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镧系元素在免疫学检测技术中的应用

2020-05-21 08:31 出处:未知 人气: 评论(
摘要:镧系元素与普通荧光相比其具有荧光衰变时间长、Stokes位移大和发射光谱窄等优点。以镧系元素及其螯合物为标记物应用到免疫分析技术中,成为目前超微量物质分析中最有发展前途的技术之一。自从时间分辨荧光免疫分析技术创立以来,经过30多年的发展,以镧系元素及其螯合物作为标记物与其他技术相结合已应用到不同的免疫检测技术中。本文就镧系元素在免疫检测技术中的应用作一综述。
 
  关键词:镧系元素,免疫学检测,应用
 
  镧系元素(lanthanide,Ln)属于稀土元素,具有独特的荧光发光特性。Soini等将镧系离子标记为示踪螯合物引入到免疫分析领域,开创了时间分辨荧光免疫分析技术,极大地促进镧系元素及其螯合物在免疫检测技术中的应用,经过30多年的发展,以镧系元素及其螯合物作为标记物与其他技术相结合已经应用到不同的免疫检测技术中。本文就镧系元素在免疫检测技术中的应用作一综述。
 
  1镧系元素及其荧光的光谱特征
 
  镧系元素是第57号元素镧到71号元素镥15种元素的统 称, 用符号Ln表示。 包括镧、 铈、 镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、 镱、镥,且它们都是属于稀土元素。与普通荧光相比,镧系元素具有独特的荧光发光特点,如:(1) 镧系离子螯合物荧光衰变时间极长,是传统荧光的103~106倍。(2)激发光与发射光之间的Stokes位移大,可达290nm,而普通荧光素通常只有几十纳米。(3)激发光谱带宽,激发最大波长在300~ 500nm,有利于增高激发能来提高灵敏度。(4)发射光谱带极窄, 甚至不到10nm, 有利于降 低本底,提高分辨率。这样就几乎完全消除了背景荧光的干扰,继而通过时间延迟和波长分辨,将强特异性荧光和背景荧光分辨开,使干扰达到几乎为零。 因其具有以上优点,使镧系元素在免疫检测技术中广泛应用。
 
  2镧系元素在免疫检测技术中的应用
 
  1983年,Soini等[1]首次将镧系离子标记为示踪螯合物引入到免疫分析领域,开创了时间分辨荧光免疫分析技术,极大地促进镧系元素及其螯合物在免疫检测技术中的广泛应用。经过30多年的发展,以镧系元素及其螯合物作为标记物与其他技术相结合已经应用到不同的免 疫检测技术中, 主要有:解离增强镧系荧光免疫分析技术、均相时间分辨免疫分析技术、光激化学发光免疫分析技术、免疫层析技术、上转换发光技术等。
 
  2.1镧系元素在解离增强镧系荧光免疫分析技术中的应用镧系元素在免疫检测技术中最早应用于时间分辨荧光免疫分析技术,而解离增强镧系荧光免疫分析 (dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay,DELFIA)技术则是目前 应用最广 泛的时间分 辨荧光免 疫分析方 法。DELFIA是Hemmila等[2]首先提出 的, 其后被广 泛应用[3,4,5,6]。 传统的DELFIA以白色透明的微孔板为固相载体非共价吸附抗原或抗体,以双功能螯合剂二乙三胺四乙酸(DDTA)等把镧系离子标记在抗 体或抗原 上,待免疫反应完成后,在低pH条件下加入增强液,使镧系离子解离下来,并与增强液中的特定成分的作用下形成强的荧光络合物,最后利用时间分辨荧光检测仪检测液相中的荧光强度。这种解离增强技术也是镧系元素及其螯合物作为标记物能实现超灵敏分析的重要因素。
 
  2012年, Hou等[7]建立一种Eu3+标记的DELFIA—磁珠时间分辨荧光免疫分析新技术对人血清中癌胚抗原(CEA)进行定量检测。在该研究中,检测CEA的灵敏度高达0.5ng/ml, 线性范围为1~1000ng/ml, 且与同类 试剂比较 相关性好,结果表明该技术可用于临床测定CEA或其他在人类血清肿瘤抗原。该技术用磁珠替代了传统的微孔板作为固相载体, 检测灵敏度更高, 更加省时,消耗试剂更 少, 是DELFIA发展的新 方向。 2013年,Hou等[8]再次利用Eu3+、Sm3+成功研制了AFP及游离-β亚基-促绒毛膜性腺激素(Freeβ-HCG)双标记磁珠DELFIA试剂盒。在该研究中AFP的最低检测浓度为0.05ng/ml,线性范围为0.1~750ng/mL,Free-β-HCG的最低检测浓度为0.08ng/ml,线性范围为0.16~450ng/ml, 与PE公司同类试剂比较具有良好的相关性。研究表明这是一种快速,灵敏度高新型免疫分析技术, 并可发展为多种分析物同时检测的临床检测平台。 目前基于DELFIA技术的研 发产品涵 盖产前筛 查、新生儿筛查、乙肝、肿瘤、性激素、甲功、糖尿病等七大系列,实现了高端定量免疫学诊断试剂的国产化。
 
  2.2镧系元素在均相时间分辨免疫分析技术中的应用均相 时间分辨 免疫分析 (homogeneous time-resolved fluoroimmunoassay, HTRF)技术是基于时间分辨荧光共振能量转移理论[9]。时间分辨荧光共振能量转移理论是指一对合适的荧光物质可以构成一个能量供体和能量受体对,如果供体的发射光谱与受体的吸收光谱发生重叠,且两个荧光发色基团足够近时,供体分子吸收一定频率的光子被激发到更高的电子能态,在回到基态前,通过偶极间的相互作用, 实现能量向邻近的受体分子转 移。由于镧系元素具有独特的荧光发光特性,使得镧系元素作为供体能与很多染料配对 组成FRET供受体对,其中TBP-Eu3+和别藻蛋白(APC)组成了迄今发现的能量转移效率最高的能量供体/受体配对。Boisclair等[10]利用以TBP-Eu3+和APC作为能量供体/受体对的HTRF技术进行泛素化抑制剂筛选, 结果表明该方法比用DELFIA法具有更好的精密度,HTRF法的CV为4%,而DELFIA法的CV为11%,可见用HTRF法可能更适合泛素化抑制剂 的高通量 筛选。Gabourdes等[11]也以TBP-Eu3+和APC作为能量 供体/受体对, 利用HTRF技术检测端粒酶活性, 为研究端粒酶的生化特征提供了一个辅助工具。
 
  2012年,Chen等[12]采用铽螯合物LTCs偶联AFP单克隆抗体E010(LTCs-E010)作为能量 供体,量子点纳米聚苯乙烯微球偶联AFP另一单克隆抗体(QPs-E014)作为能量受体, 以供体与受体因抗原与抗体的相互作用而产生的时间分辨荧光共振能量转移机制为切入点,从而建立一种量子点均相时间分辨荧光免疫分析技术。该技术充分利用镧系铽螯合物与量子点的特异性光学性质具有具有无放射性污染,灵敏度高,背景荧光低,性质稳定等优点。2013年Chen等[13]也进行了利用量子点均相时间分辨荧光免疫分析技术检测人血清CEA的研究,拓展了此技术在临床检测生物标志物中的应用。均相时间分辨免疫分析技术操作快速简便,省去了洗涤分离和加增强液等繁琐步骤,易于微型化自动化,应用范围广,对疾病的及早发现和预防起重要作用。
 
  2.3镧系元素在光激化学发光免疫分析技术中的应用光激化学发光免疫分析技术(AlphaLISA)是一种新型微量定量免疫分析检测技术,建立于高灵敏度的AlphaScreen(amplified luminescent proximity homogeneous assay)技术上。该技术理论于1994年, 由Ullman等[14]提出的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术,主要依赖于感光微球和发光微珠的相互作用。当生物分子存在相互作用时,这种相互作用会将供体和受体微珠拉近,从而激发级联放大的化学反应, 产生极大增强了的信号。在波长为680nm激发光的照射下,供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠,产生一系列的化学发光反应,最后将能量传递到铕,发出发射波长为615nm的时间分 辨荧光。单体氧的 半衰期为4μs,在溶液中的扩散距离约为200nm, 当生物分子不存在特异的互相作用时,单体氧无法扩散到发光微球,则不会有信号产生。在AlphaLISA技术中,镧系元素铕作为发光物质包埋在微球里面作为发光微球, 免受环境干 扰, 有利于减少本底信号。同时铕的发射光较短(615nm), 远低于激发光波长(680nm), 避免了激发光对测量的干扰,此外铕的发射光谱非常尖锐,基本不会受到样品的淬灭干扰,是进行复杂样品检测的理想选择。由于从感光微球受到激发到发光微球产生发射光的整个反应的半衰期为0.3s,可使用时间分辨荧光免疫分析技术的检测模式,进一步降低了背景,确保了结果的真实性。
 
  2013年He等[15]研制了一种基于AlphaLISA定量检测人血清细胞角蛋白片段抗原(CYFRA 21 –1)试剂盒,该试剂盒的灵敏度达0.08ng/ml, 线性检测范围 宽达0.08~500ng/ml, 与Roche ECLIA法结果比较, 相关性良 好。2013年,Liu等[16]建立了一种AlphaLISA定量检测人血清HBsAg的新方法, 耗时短, 只需孵育15 min,灵敏度高,达0.01IU/ml;线性检测范围宽,为0.04 ~100IU/ml,研究结果表明该方法可用于临床检测人血清HBsAg,并为其他低丰度生物标志物的灵敏检测提 供了一个 通用平台。2014年, Wang等[17]研究结果表明,利用AlphaLISA可以进行高通量检测可溶性淀粉样前体蛋白水平。以上研究均表明AlphaLISA具有高通量,省样本, 标准曲线范围宽, 灵敏度高, 时间分辨能力强, 背景荧光低,无放射性污染,应用范围广,性质稳定,便于操作,易于微型化自动化,价格低廉等优点,并且本方法检测时间短,可实现快速诊断,显示了该技术将在现在及未来的免疫分析检测领域重要的作用。
 
  2.4镧系元素在免疫层析技术中的应用免疫层析 (immunochromatography assay,ICA)技术是20世纪90年代初兴起的一种将抗原抗体免疫学反应和色谱层 析技术相 结合的固 相膜免疫 分析技术[18]。它是利用标记物的显色特性及层析法的分离技术对待测物进行定性或定量的一种新型快速免疫检测技术。而将镧系元素和免疫层析技术相结合形成的基于时间分辨荧光免疫分析的层析技术,在检测带上针对待测物的受体标记一种或多种镧系螯合物或包埋镧系螯合物的微球,最后检测螯合物的荧光信号,参照标准浓度曲线对待测样品浓度进行定量检测[19]。
 
  Juntunen等[20]利用一种包埋铕的聚苯乙烯纳米微球作为标记物的免疫层析技术进行生物亲和性分析研究,在前列腺特异性抗原实验结果表明,铕纳米微球的荧光检测的灵敏度要比胶体金法高300倍。该方法可以有效排除背景荧光的干扰,灵敏度高,且能够对待测物进行定量测定。由于每个微球中可包裹成千上万个荧光分子,大大提高了荧光的标记效率,有效提高了分析灵敏度;同时荧光微球表面修饰有功能基团,用于与蛋白或抗体的共价偶联,提高了标记物的稳定性。更重要的是微球包埋的稀土离子已经过了螯合,无需解离增强步骤,因此从根本上解决了传统的DELFIA法只能在液相中而不能在固相界面反应的问题,从而解决了将时间分辨荧光应用于免疫层析的技术瓶颈,在此基础上可开发出灵敏度高于普通胶体金或有色乳胶免疫层析方法1-3个数量级的定量检测技术。另外,为识别不同待测物,可通过标记微球结合特定单抗, 实现多标记检测的目的。因此,将镧系元素应用到免疫层析技术中,是免疫层析技术朝着定量、高灵敏度、多标记检测的一个重要的发展方向。
 
  2.5镧系元素在上转换发光技术中的应用上转换发光技术(up-converting phosphor technology, UPT)是上转换 发光材料 (up -converting phosphor,UCP)在一种长波长光激发下发射短波长光的现象[21]。UCP是由2种不同稀土镧系元素离子掺杂入纳米尺寸(10~20nm)的陶瓷颗粒中,构成的一类能上转换发光的示踪材料,其最大的特点是低能光激发,高能光发射。UCP主要以常见的三价镧系离子如铒离子(Er3+)、钕离子(Nd3+)、 铥离子(Tm3+)和钬离子(Ho3+)等作为激活剂, 加入镱离子 (Yb3+)作为敏化 剂, 而形成Yb3+-E r3+,Yb3+-Pr3+,Yb3+-T m3+和Yb3+-Ho3+共激活的发光材料。对上转换发光材料进行一系列的表面修饰与活化后,用其作为生物标记物来标记多种生物活性分子,以其独特的上转换发光特性来反映生物活性分子之间高特异性与高敏感识别。上转换发光材料作为新型生物标记物, 具有“四高”的优点,即高度的敏感性,不存在背景荧光干扰;高度的灵活性, 可适用于多重 定量分析,高度的稳定性,不会存在被检测样品腐蚀和自身衰变导致发光淬灭的现象,高度安全性, 对检测者、 被检测样品、环境均无任何危害。
 
  2009年,Li等[22]采用了NaYF4:Yb3+-Er3+上转换发光材 料作为标 记物, 开发了一 种基于UPT用于快速定量检测HBsAb的生物传 感器, 通过检测标准品和血清样品对其性能进行分析并同雅培的AUSAB法和传统的ELISA法进行系统的比较,UPT生物传感 器检测显 示了最佳 的灵敏度,研究结果表明该UPT生物传感器可用到临床检测上。2010年,Hong等[23]开发了一种上转发光技术10重检测免疫层析分析系统,该系统可以在同一样品中一步法同时定量检测10个目标分子。 该系统中10条试纸条 都采用了 相同的UCP (NaYF4:Yb3+-Er3+),因此不需要复杂的光学仪器,其独特的免疫光谱检测避免了在一个试纸条上同时进行多个目标检测的非特异性结合与空间位阻的风险。该系统已成功应用于分析抗鼠疫菌,并具有良好的可 重复性, 灵敏度, 特异性和 稳定性。 Hong等的研究结果确认了F1抗原的诊断意义, 并且还发现LcrV和YopD是鼠疫潜在的诊断标志物。这是一种多用途的平台,不仅可以用于多种抗体的检测,也适用于多种病原体检测和对基础研究潜在的疫苗靶标进行评估。将上转换发光技术与免疫层析技术、光学传感技术相结合来研制上转发光免疫生物传感器和上转发光技术多重检测免疫层析试剂盒等已被广泛报道[23,24,25,26],并取得了令人满意的效果。上转换发光技术应用于免疫学检测领域能够充分发挥其特性,可以实现超高灵敏度的免疫学检测,在各种免疫学检测技术中将得到广泛的应用。 2.6其他1987年,Diamamdis等[27]以Eu3+螯合物配基4,7-二氯磺酰基苯-1,10-邻菲啰啉-2, 9-二羧酸(BCPDA)为标记物, 建立一种固相荧光免疫分析(DSLFIA)技术,实现固相测量,并引入生物素-亲和素信号放大系统, 在一定程度上弥补了直接利用BCPDA检测灵敏度不足的问题。
 
  1991年, Evangelista等[28]采用水杨酸类螯合剂,结合了稀土元素螯合物荧光的高度可检测性和酶分子的高效信号放大作用,创立了一种酶放大镧系发光分析(EALL)技术。最常用的是以碱性磷酸酶催化5-氟水杨酸磷酸酯(5-FSAP)生成5-氟水杨酸(5-FSA),与反应液中的Tb3+和乙二胺四乙酸 (EDTA)在一定pH下形成强荧光络合物,直接测定荧光。Diamamdis等利用该 技术建立 了PSA、 TSH、P53蛋白等多种待测物的超灵敏TRFIA。
 
  联吡啶类及一些大环类化合物的衍生物同一些稀土离子形成的穴状螯合物,由于稳定性较好也被用于TRFIA中[29],且有较强的荧光和较大的稳定常数,使其有望替代现在常用的稀土离子螯合物。
 
  3结语
 
  综合目前的研究结果可以看出,镧系元素在免疫检测技术中得到了广泛应用,在提高灵敏度、特异性、简化操作、缩短检测时间等方面,取得了很好的效果。但也存在一些缺点, 如DELFIA技术操作繁琐,易受到环境污染,且只适合液相进行,UPT中上转换发光材料颗粒表面的生物相容性较差,且发光效率较低;DSLFIA技术检测灵敏度较低等。同时也尚存有待解决的问题:尽管各种技术的分析仪器已不同程度地实现国产化,但在功能和性能方面与国外相比都还有一定距离,尤其是在仪器的自动化方面,表现尤为不足,限制了各种技术的推广。
 
  “石油在中东,稀土在中国”,中国作为稀土资源大国,一定要实现稀土资源的高端利用,随着对仪器研发技术的不断探索与深入,国产分析仪器的性能会越来越好,功能更多,自动化程度更高。相信在不久的将来,随着各学科之间交叉互补、交叉渗透, 镧系元素与其他技术的联合应用必将推动人们不断研究、 开发出更新更理想的免 疫检测技术,必使其在免疫学检测技术上大放异彩。
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