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吸入型平喘药的人体血药浓度测定方法的研究进展

2020-05-27 14:25 出处:未知 人气: 评论(
摘    要:
吸入型平喘药包括吸入型糖皮质激素、吸入β受体激动剂和吸入M受体阻断剂,是支气管哮喘与慢性阻塞性肺病首选和常用治疗药物。吸入型平喘药的原研药物大多价格昂贵,然而其仿制药市场份额与原研药物相比却极其微小,主要原因在于现有的吸入平喘药仿制药在疗效和安全性上难以与原研药物保持一致。为了保障吸入平喘药的临床疗效与安全性,有必要进行相应的生物等效性评价研究。这就需要体内药物分析方法提供支持。然而,吸入平喘药因给药剂量低、给药途径特殊等原因而具有血药浓度极低的特点,这使其定量检测具有一定困难。因此,开发和优化吸入型平喘药血药浓度测定方法具有重要意义。本文综述了国内外吸入平喘药血药浓度测定方法,为其临床药动学研究和生物等效性评价提供依据。
 
关键词:
吸入型平喘药; 人体; 血药浓度; 测定方法; 液质联用法; 灵敏度; 基质效应;
 
 
Progress on the analytical methods determining inhaled antiasthmatics in human plasma

 
Abstract:
Inhaled antiasthmatics, including inhaled corticosteroids, inhaled beta agonists, and inhaled M receptor blockers, are the preferred and commonly used treatments for bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Most of the original drugs are expensive. However, the market share of the generic drugs is extremely small compared with the original drugs, mainly because the existing generic inhaled antiasthmatic drugs are difficult to maintain consistency in efficacy and safety with the original drugs.. In order to ensure the clinical efficacy and safety of inhaled antiasthmatic drugs, it is necessary to conduct corresponding bioequivalence evaluation studies. This requires support from determining methods of biopharmaceutical analysis. However, inhalation antiasthmatic drugs have the characteristics of extremely low blood concentration due to low dosage and special administration route, which makes it difficult for them to be quantitatively detected. Therefore, it is of great significance to develop and optimize the method for determining the plasma concentration of inhaled antiasthmatic drugs. The domestic and abroad methods for determination of plasma concentration of inhaled antiasthmatic drugs are reviewed in this article, providing basis for its clinical pharmacokinetic studies and bioequivalence evaluation.
 
Keyword:
inhaled antiasthmatic drugs; human body; plasma concentration; determination method; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sensitivity; matrix effect;
 
吸入型平喘药是指经过口腔吸入至肺部发挥疗效的平喘药物,其种类包括吸入型糖皮质激素、吸入β受体激动剂和吸入M受体阻断剂。因具有直接抵达作用部位、起效快和系统暴露量小从而更少导致不良反应等优势[1],吸入型平喘药成为支气管哮喘和慢性阻塞性肺病的首选和常用治疗药物[2]。然而,吸入型平喘药的原研药物大多价格昂贵,但其仿制药市场份额与原研药物相比却极其微小,主要原因在于现有的吸入平喘药仿制药在疗效和安全性上难以与原研药物保持一致。为改变仿制药疗效与安全性参差不齐且难以与原研药保持一致的现状,国务院办公厅在2016年印发《关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》[3],要求化学药品新注册分类实施前批准上市的仿制药,凡未按照与原研药品质量和疗效一致原则审批的,均须开展生物等效性评价。因此,为了保障吸入平喘药的临床疗效与安全性,有必要进行相应的生物等效性评价研究。为指导仿制药生物等效性评价工作而在2016年3月出台的《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》指出[4],化学药物仿制药的生物等效性研究方法包括药动学研究、药效学研究、临床研究和体外研究。其中,药动学研究因在对比参比制剂和受试制剂的差异上具有更强的区分性而成为多数药物生物等效性研究的首选方法[4]。对于吸入药物而言,改良的药动学方法,包括20 min采血药动学法[5]和活性炭阻断药动学法[6],正和传统药动学方法相结合,在吸入药物的生物等效性评价中扮演日趋重要的作用[7-9]。本文综述吸入型平喘药人体血药浓度测定方法,为其临床药动学研究和生物等效性评价提供依据。
 
1 免疫分析法
免疫分析法是最早应用于吸入平喘药人体血药浓度检测的传统方法。其原理是基于抗原-抗体反应或受体-配体结合反应从而实现定量分析。Kunikazu等[10]采用放射免疫分析法测定福莫特罗血药浓度,步骤包括反应物的合成、抗原的制备和血浆中福莫特罗的提取并检测,定量下限为100 pg·mL-1。Ensinger等[11]利用放射受体分析法测定异丙托溴铵血药浓度,步骤包括血浆中药物两次萃取、膜匀浆的制备、孵化、过滤、洗涤后测定,定量下限为20 pg·mL-1。免疫分析法虽然灵敏度尚可,但因操作复杂、耗时长,且容易产生交叉反应干扰检测等原因,现已基本不用于吸入平喘药血药浓度测定。
 
2 高效液相色谱法
国内外均较少有文献报道使用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定吸入平喘药血药浓度。仅有个别文献报道检测福莫特罗[12-13]和特布他林[14-15]的血药浓度:进样检测前均采用固相萃取法[17-20]萃取血浆中药物;色谱柱选择C8柱[13,15]、C18柱[12]和OA手性柱[13];检测器有电化学检测器[12-13,15]和荧光检测器[14];定量下限较高,多在1 ng·mL-1以上[12,14-15]。其中,仅Campestrini等[12]开发的HPLC法被用于人体吸入福莫特罗临床药动学研究。对于吸入平喘药而言,HPLC法灵敏度低、选择性差,且单个样品运行时间较长,已很少用于其血药浓度测定和生物等效性评价。
 
3 液相色谱-质谱联用法
人体吸入平喘药物后,其血药浓度常低至pg·mL-1级别[16-18]。液相色谱-质谱联用法简称液质联用法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)因具有灵敏度高、选择性强的双重优势而成为吸入平喘药人体血药浓度测定的主流方法。文献报道的吸入型平喘药血药浓度测定方法概述于表1中。液质联用法的分析步骤包括样品前处理、液相色谱分离和质谱检测。
 
表1 吸入型平喘药人体血药浓度测定方法
 
 
表1 吸入型平喘药人体血药浓度测定方法

 
3.1 样品前处理
样品前处理的目标是纯化和富集分析物。人血浆中不仅含有待测药物与代谢物,还含有盐类、糖类、脂质和蛋白质等内源性成分[48]。这些内源性成分带来的基质效应会严重影响待测药物与代谢物的离子化效率,进而影响化合物的质谱响应和检测灵敏度[48]。理想的样品前处理步骤能够去除这些干扰物质,从而减轻甚至消除基质效应,提高检测响应和方法灵敏度。常用的样品前处理方法主要包括蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法和其他方法。如何选择合适的样品前处理方法取决于待测化合物的理化性质、目标浓度、生物样品基质以及仪器情况等。
 
3.1.1 蛋白沉淀法(protein precipitation, PPT)
PPT是操作最简便,耗时最少的样品前处理方法。蛋白沉淀法的操作步骤一般包括:将蛋白沉淀剂加入到血浆和内标的混合物中让蛋白质变性,涡旋混匀,离心取上清液后进样检测。常用的蛋白沉淀剂包括甲醇、乙醇和乙腈。
 
血浆样品可仅经过蛋白沉淀处理后取上清液直接进样。Zhou等[40]仅采用PPT处理含班布特罗及其代谢物的人血浆样品,涡旋离心后取上清液直接进样,避免了吹干复溶环节。当上清液的药物浓度太低,直接进样无法达到要求的灵敏度,此时可选择上清液氮气吹干后复溶进样以浓缩来提高检测响应。马敏康等[38]使含沙丁胺醇的人血浆样品经PPT处理后取全部上清液氮气吹干,再用150 μL流动相复溶进样,进样体积2 μL,定量下限11.7 pg·mL-1,灵敏度高。此外,适当增大进样体积可提高灵敏度。严青叶等[37]采用PPT做了类似的研究,但将进样体积提高到20 μL,定量下限达5 pg·mL-1。
 
蛋白沉淀法虽然简便、快速,但无法去除血浆中除蛋白质以外的其他物质,因而样品净化程度低,可能导致强烈的基质效应。众所周知,磷脂是导致严重基质效应从而影响质谱响应的干扰物质且常规方法难以去除。近年来,生物分析领域的一项重要进展就是生物分析学家对磷脂导致的基质效应进行了深入研究并得到了去除生物样品中磷脂的方法。磷脂去除板如Ostro、PHREE、Captiva ND lipids等的应用可使基质效应干扰响应和灵敏度的问题迎刃而解。Nilsson等[22]使用Ostro板处理布地奈德血浆样品,将血浆、内标、沉淀剂(含2%甲酸的乙腈)加入该板中,混匀沉淀后过滤,滤液进入固相萃取板中净化,定量下限50 pg·mL-1,避免了基质效应的产生。
 
3.1.2 液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)
LLE利用分析物在有机相和水相之间不同的分配系数而萃取分析物至分配系数较大的一相中,再吹干复溶,从而达到净化和富集分析物的目的。液液萃取法往往能获得较为干净的提取物,从而减轻基质效应。提取溶剂的选择应基于分析物的理化性质如极性、油水分配系数等。对于吸入平喘药,文献报道的提取溶剂包括乙酸乙酯[41]、乙醚[28]、二氯甲烷[40]、二异丙醚[31]、甲基叔丁基醚[32]以及混合溶剂[25,34]。
 
为增加提取回收率,提高质谱响应,应加入适当pH调节剂使分析物以分子形式存在于提取体系中。碱性药物应加入碱性试剂,碱性pH调节剂常用氨水和碳酸钠。Zhang等[36]提取人血浆中沙丁胺醇,使用碳酸钠调节pH至7以上。另外,酸性药物应加入酸性试剂,酸性pH调节剂包括酸性缓冲盐和盐酸。Storme等[45]提取人血浆中格隆溴铵,加入甲酸/甲酸铵缓冲盐。Wang等[46]萃取人血浆中噻托溴铵,加入盐酸,但盐酸的酸性过强,容易损坏色谱柱。
 
大多数方法将分析物直接提取至有机相中,吹干后复溶进样检测。但也有少数方法进行反萃取,将分析物提取至水相中。Chi等[18]采用反萃取法提取血浆中噻托溴铵,先用二氯甲烷萃取有机层中药物,吹干复溶后,加入甲基叔丁基醚并弃去有机层,获得水相中的药物;该法有效消除了基质效应,使检测灵敏度显著提高,定量下限可达0.2 pg·mL-1。
 
当分析物是离子化合物时,通常需要加入挥发性离子对试剂,以提高分析物的提取回收率。Storme等[45]采用易挥发的七氟丁酸作为离子对试剂,萃取人血浆中格隆溴铵,提取回收率接近于50%。对于强极性化合物,液-液萃取回收率低,可通过加入饱和盐溶液增加其在有机相中的溶解度,增大回收率。Chi等[18]以二氯甲烷提取人血浆中噻托溴铵,通过加入饱和碘化钾溶液使其从溴盐转化为碘盐,从而增加在萃取剂中的溶解度,低、中、高浓度回收率分别达63.0%、59.8和69.6%。
 
此外,当提取回收率较低,且样品间回收率不一致时,可尝试在氮气吹干前用二甲基亚砜溶解样品。Mascher等[31]用二异丙醚提取人血浆中环索奈德及其代谢物去异丁酸酯环索奈德,以二甲基亚砜溶解后再吹干复溶进样,提取回收率分别高达100%和108.4%。
 
液-液萃取法也有一些缺点如,操作复杂、耗时长、有机溶剂消耗量大、易形成乳化层导致提取回收率降低等。
 
3.1.3 固相萃取法(solid phase extraction, SPE)
SPE是利用固相萃取小柱对分析物与干扰物质保留能力不同而实现两者分离的样品前处理方法,步骤一般包括固相萃取柱活化、上样、洗除干扰物质,最后用溶剂洗脱分析物,直接进样或吹干复溶进样,从而实现富集与净化的目的。
 
为了成功检测吸入平喘药血药浓度,曾有学者尝试提高血浆用量和萃取后吹干浓缩复溶,这虽然能提高灵敏度,但这会带来显著的基质效应[22,39]。SPE净化生物样品能力强,基质效应较小;且其萃取小柱和洗脱剂种类丰富,适用于几乎所有的极性和非极性的吸入平喘药的提取。因此,SPE是吸入型平喘药最常用的样品前处理方法。对于吸入平喘药,文献报道的萃取小柱包括C18柱[17]、C8柱[19]、C2柱[26]、HLB柱[22]、强阳离子交换柱[16]和混合型阴离子交换柱[30,39]。大多数物质可用C18柱完成富集和净化,回收率在70%~90%之间。C8柱适用于脂溶性药物。脂溶性高的药物常与血浆蛋白紧密结合,萃取前向血浆中加入沉淀剂,使药物游离出来,将上清液转入SPE柱进行萃取可提高提取回收率,提高检测响应。Daley-Yates等[19]提取人血浆中丙酸倍氯米松及其代谢物,蛋白沉淀后取上清液进入C8柱萃取,丙酸倍氯米松与其代谢物定量下限达50 pg·mL-1。个别药物如布地奈德被报道采用C2柱能减轻基质效应[26]。而HLB柱的优点是即便柱床干涸,也不影响提取回收率[22]。
 
对于上述SPE小柱无法获得较好保留的吸入平喘药,如福莫特罗和沙美特罗等,可尝试采用强阳离子交换柱[16]和混合型阴离子交换柱[39]提取人血浆中的药物。混合型阴离子交换反相吸附剂具有阴离子交换保留和反相保留的双重保留机制,能对药物和极性更大的代谢物同时实现保留。Nair等[30]采用混合型阴离子交换反相吸附剂作为提取材料,同时萃取人血浆中氟替卡松及其代谢物17-β羧基氟替卡松,实现了两者在固相萃取小柱上较好的保留,洗脱液为1 mmol·L-1三氟乙酸铵甲醇溶液;结果回收率氟替卡松>80%,代谢物17-β羧基氟替卡松>90%,定量下限可达0.5 pg·mL-1。
 
值得注意的是,应避免在提取过程中使用非挥发性试剂。陈笑艳等[44]以SPE处理人血浆中特布他林,使用非挥发性的磷酸盐作为缓冲液。这可能导致离子源的污染以及严重的离子抑制效应。
 
SPE的主要缺点是固相萃取小柱价格相对昂贵,且血浆用量不宜太大,否则会堵塞萃取小柱。
 
3.1.4 其他方法
班布特罗是一类手性平喘药,研究表明[42](S)-班布特罗治疗作用差且导致严重心脏毒性,而(R)-班布特罗表现出显著平喘作用,因此有必要建立立体选择性的生物分析方法对班布特罗对映体进行临床药动学研究。使用手性固定相色谱法虽是分析对映体浓度的传统方法,但其具有分析时间长、灵敏度低等缺点,且手性固定相色谱法配套的低极性流动相不利于分析物在质谱的离子化。对班布特罗进行衍生化处理可解决这些问题。但传统衍生化法反应耗时太长。微波辅助衍生化法(microwave-assisted derivatization, MACD)产生的微波介质加热可使反应迅速升温,从而使反应时间大幅缩短,衍生化效率大幅提高[42]。Zhou等[42]采用MACD法对人血浆中班布特罗进行衍生化,衍生化试剂为二乙酰基-L-酒石酸酐,微波辐射功率为400 W,温度60 ℃;该法分析时间短,色谱分离时间仅3 min,灵敏度高,定量下限可达2.5 pg·mL-1,适用于班布特罗临床药动学研究。
 
3.2 液相色谱分离
良好的液相色谱分离应使药物与代谢物均在色谱柱上获得保留,但又被有效分离。同时,应尽可能将生物基质与分析物分离开,避免在同一时间洗脱至质谱离子源,从而减轻或消除基质效应。在达到上述要求的前提下,还应调整流速和流动相组成等因素,尽可能缩短分析时间。
 
3.2.1 反相色谱法
反相C18色谱柱是测定吸入平喘药血药浓度最常用的色谱柱。为与C18柱和质谱系统相匹配,流动相常选择易挥发的甲醇-水[28,41]、乙腈-水[37,46]或乙醇-水[23]体系,而禁止使用非挥发性的物质,因为后者在离子源中难以挥发,将带来严重的质谱响应抑制效应。
 
为优化色谱峰形并调节分析物的保留能力以获得稳定的保留时间,需要向流动相中加入酸碱调节剂。对于吸入平喘药,大多数检测模式为正离子模式,而酸性洗脱液能给出质子,有利于分析物质子化。因此,甲酸、乙酸、乙酸铵和甲酸铵是使用最多的酸碱调节剂。值得注意的是,应避免使用浓度过高的乙酸铵,否则可能会堵塞色谱柱甚至抑制分析物的质谱响应。Li等[47]测定人血浆中噻托溴铵浓度,使用的乙酸铵浓度约为20 mmol·L-1,与液质系统难以兼容。
 
此外,离子化合物因为极性强而难以在C18柱上保留,向流动相中添加离子对试剂,改变分析物的极性可增强其保留能力。Storme等[45]测定人血浆中格隆溴铵浓度,色谱柱为C18柱,向流动相中加入挥发性离子对试剂七氟丁酸,使其在C18柱上得到保留,结果保留时间为6.82 min。
 
色谱洗脱方式分为等度洗脱和梯度洗脱。药物代谢物的极性常大于原形药物,在同时测定血浆中药物与代谢物浓度时,为使药物与代谢物在C18柱上既被保留但又能被有效分离,常采用梯度洗脱方式。Mascher等[31]采用C18柱,梯度洗脱,同时测定人血浆中环索奈德与代谢物去异丁酸酯环索奈德,保留时间分别为2.4 min和1.8 min。Zhou等[40]以C18柱为色谱柱,梯度洗脱,同时检测人血浆中R-班布特罗及其代谢物R-特布他林浓度,保留时间分别为4.8 min和3.6 min,向流动相中加入乙酸铵,避免了色谱峰拖尾。
 
反相C8色谱法亦可应用于吸入平喘药的血药浓度检测。Ji等[17]选用C8柱测定人血浆中氟替卡松,在对比了C18柱和C8柱后发现使用C8柱时响应值更高,且避免了C18柱引起的柱压过高现象。
 
3.2.2 超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography, UPLC)
与普通高效液相色谱相比,UPLC分离能力更强,色谱峰形更好,分析灵敏度更高,更少受到基质效应干扰;同时,UPLC能耐高压,流速较快,因而分析速度更快。人体吸入平喘药后,血药浓度极低,且生物等效性试验中采血点多,样品量大[49]。UPLC因灵敏度高,分析时间短而十分适用于吸入平喘药的血药浓度分析。一些学者报道了使用UPLC-MS/MS法来同时测定人血浆中药物与代谢产物浓度,如班布特罗与代谢物特布他林[41-43]、布地奈德对映体[22,25]、氟替卡松与代谢物17β-羧酸氟替卡松[30]等,药物与代谢物均得到有效分离,且分析时间短,定量下限低,适用于生物等效性评价试验。
 
3.2.3 亲水作用色谱法(hydrophilic interaction chromatography, HILIC)
HILIC适用于在传统C18色谱柱上难以保留的强极性药物与代谢物的分析。与C18柱所用的低比例有机相为流动相不同,HILIC对应的流动相常为高比例的有机相,后者挥发性更好,不与分析物竞争离子化位点,从而提高了检测响应和方法灵敏度。沙丁胺醇分子中含有多个羟基,极性强,难以在C18柱上保留,马敏康等[38]建立了亲水作用色谱-串联质谱法测定人血浆中沙丁胺醇浓度,流动相为含0.1%甲酸的乙腈溶液-5 mmol·L-1乙酸铵(pH调至8.5)(93∶7, v/v),等度洗脱;结果沙丁胺醇保留时间为2.2 min,定量下限达11.7 pg·mL-1。Zhou等[43]建立HILIC-MS/MS方法测定人血浆中班布特罗与2种主要代谢物班布特罗单氨基甲酸酯和特布他林,流动相采用乙腈-水(50/50, v/v, 含10 mmol·L-1乙酸铵和0.1%甲酸)(A)-乙腈-水(95/5, v/v, 含10 mmol·L-1乙酸铵和0.1%甲酸)(B) 体系,梯度洗脱;实验对比了C18柱和HILIC柱,结果表明HILIC柱在色谱峰对称性、柱效和柱压上都优于反相C18柱,方法定量下限达10 pg·mL-1,分析时间仅4 min。
 
3.2.4 手性色谱法
吸入平喘药对映体分子量相等,无法通过质谱加以区分并定量检测其血药浓度,需要经过手性色谱柱分离后进入质谱检测。一些学者分别建立了手性色谱-质谱联用法分离并测定血浆中班布特罗与代谢物班布特罗单氨基甲酸酯和特布他林的所有对映体[41]和非诺特罗对映体[35],结果这些对映体均能在手性色谱柱上有效分离,为吸入平喘药的手性药动学研究提供了依据。
 
3.2.5 二维色谱法
二维色谱法利用药物与生物基质在不同色谱柱上保留能力不同的特点实现分离。Chi等[18]采用C18柱与氰基柱联用的二维色谱法测定人血浆中噻托溴铵浓度,使C18柱上无法完全分离的药物与基质在氰基柱上得到进一步分离,从而大幅度降低基质效应,提高灵敏度,定量下限低至0.2 pg·mL-1。Carter等[29]以C8为预柱,C18为分析柱,检测人血浆中沙美特罗,结果沙美特罗从预柱中被洗脱至分析柱而生物基质被保留在预柱上,从而有效减少基质效应,定量下限2.5 pg·mL-1。此外,二维色谱法还可用于2种药物的分离。Silvestro等[28]分析人血浆中氟替卡松和沙美特罗时,将C18柱和阳离子交换柱联合使用,前者用来保留氟替卡松,后者用来保留沙美特罗,使两者有效分离,结果定量下限分别为2.5 pg·mL-1和1.5 pg·mL-1。
 
3.3 质谱检测
质谱仪相对于紫外、荧光灯检测器有着选择性高、灵敏度强的特点,尤其适用于吸入型平喘药的生物样品分析。质谱检测的关键环节是分析物离子化。常见的离子化方式包括电喷雾离子化(electrospray ionization, ESI)、大气压化学离子化(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)和近年来兴起的大气压光离子化(atmospheric pressure photo ionization, APPI)。其中ESI适用于强极性化合物,APCI适用于弱极性化合物,而APPI可替代ESI与APCI去电离一些离子化效率低的化合物。质谱工作模式可分为单离子监测(single ion monitoring, SIM)、选择反应监测(selective reaction monitoring, SRM)和多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)。此外,质谱仪的正负离子检测模式可根据化合物的酸碱性来选择,但每种不同化合物的最佳选择需要在实验中进行具体探索。
 
3.3.1 ESI
ESI是吸入平喘药血药浓度测定中应用最多的离子化方式。
 
当监测单一离子反应不能达到预期灵敏度时,同时监测多个离子反应,提高方法灵敏度。马敏康等[38]测定人血浆中沙丁胺醇浓度,同时监测离子反应m/z 240→m/z 148和m/z 240→m/z 166,定量下限达11.7 pg·mL-1。
 
然而,有时候分析物会在正离子模式下形成钠、钾加合物[M+Na]+和[M+K]+,导致[M+H]+的响应值降低,方法灵敏度下降。此时,可选用负离子模式来提高方法灵敏度。Lu等[25]采用负离子模式监测人血浆中布地奈德对映体,监测母离子乙酸根离子加合物[M+CH3COO]-,避免了[M+Na]+和[M+K]+对质谱响应的干扰,定量下限为5 pg·mL-1。Wang等[24]做了类似研究,测定人血浆中布地奈德与代谢物6-OH布地奈德和16-OH泼尼松龙浓度,前两者监测母离子[M+CH3COO]-,后者监测母离子[M-H]-,三者定量下限均为100 pg·mL-1。Silvestro等[28]以负离子模式检测人血浆中氟替卡松,在尝试了[M+CH3COO]-和[M-H]-后,最终选择监测响应更强的[M+CH3COO]-母离子,定量下限达2.5 pg·mL-1。
 
3.3.2 APCI
APCI的使用频率较ESI低,这可能是因为对于大多数吸入平喘药,APCI灵敏度不如ESI。Wang等[46]尝试以ESI和APCI分别监测人血浆中噻托溴铵,最终选择灵敏度更高的ESI。然而,与ESI相比,APCI较少受到基质效应的干扰。Carter等[29]以APCI为离子化方式,测定人血浆中氟替卡松,避免了使用ESI导致的质谱响应抑制。
 
另外,应避免选择不稳定的离子进行监测。Streel等[26]采用APCI监测人血浆中布地奈德对映体,监测母离子[M—CH3COO—],结果产生2种子离子m/z 59和m/z 357,考虑前者来自脱乙酰基反应,稳定性差,最终选择后者作为子离子来监测。值得注意的是,应使APCI放电针保持干净,从而获得最大的离子化效率,提高灵敏度。
 
3.3.3 APPI
APPI作为新兴的软电离离子化方式,能电离一些使用ESI和APCI后离子化效率仍很低的化合物,且能有效降低基质效应,提高灵敏度。
 
近年来,将掺杂剂直接加入流动相中成为一种创新的做法,能显著提高方法灵敏度。Mascher 等[31]采用APPI监测人血浆中环索奈德与代谢物去异丁酸酯环索奈德浓度,摒弃了将掺杂剂丙酮加入通过外部泵加入离子源的做法,而是直接将其加入到流动相中。结果噪音显著降低,信噪比大幅度提升,且与ESI和APCI相比,灵敏度提高约4倍,定量下限达10 pg·mL-1。
 
3.3.4 内标物的选择
内标物的使用能校正在样品前处理、色谱分离和质谱检测中任何环节产生的误差,因此吸入型平喘药血药浓度检测均使用内标法。内标物可分为结构类似物和稳定同位素标记物。结构类似物成本相对低,且容易获得,但消除误差的能力较弱,容易受生物基质影响而导致与分析物的离子化效率不一致。选用稳定同位素标记物作内标可以解决这一问题。稳定同位素内标是分析物中的几个原子被稳定同位素取代获得的产物,与分析物的理化性质极其相近,在生物分析任何环节均与分析物表现类似行为,因而消除误差能力强,但一般较难获得且价格昂贵[18,22,29-30]。
 
4 总结
本文综述了吸入型平喘药人体血药浓度测定方法。吸入型平喘药由于给药剂量低、给药途径特殊等原因而具有血药浓度极低的特点,这就要求生物分析方法灵敏度要高。免疫分析法曾用于吸入平喘药血药浓度浓度检测,但其特有的交叉反应导致检测结果不准使其逐渐退出了历史舞台。液相色谱法因其灵敏度低,选择性差且分析耗时长,现在亦较少应用。液质联用法具有灵敏度高、专属性强、能对生物基质中药物及其代谢产物进行同时测定等特点而成为测定吸入型平喘药血药浓度的主要方法。
 
应用液质联用法时,提高灵敏度的方法包括:(1)浓缩法:增大血浆用量,或增大色谱进样量,或使用氮气吹干复溶。这些方法虽然能浓缩样品,但基质效应也会同时增强,最终灵敏度可能不会有显著提高。并且在药物临床试验中,采血量会受到一定限制。(2)换用更新一代的质谱仪。(3)选用粒径更小的色谱柱,产生更尖锐而对称的峰形,从而获得更大的信噪比。(4)使用LLE或SPE浓缩样品并去除生物基质。(5)流动相中添加酸碱调节剂,使分析物尽可能全部以分子或全部以离子形式洗脱,有利于色谱峰形的改善也有利于质谱中分析物离子化。(6)使用超高效液相色谱法。(7)强极性化合物使用HILIC柱以增强保留。(8)同时监测多个离子反应,提高信噪比。(9)正离子模式下出现钠、钾加和物的情况下,可换用负离子模式监测。(10)经常维护质谱仪,保持电晕放电针的清洁。(11)ESI或APCI灵敏度低时,换用近年来新兴的APPI,且可尝试将掺杂剂直接加入流动相中。
 
此外,基质效应是影响液质联用法灵敏度的一个重要因素。减少或消除基质效应的方法包括:(1)优化样品前处理方法:使用LLE或SPE代替PPT或联合应用,如PPT+LLE或PPT+SPE,除去蛋白沉淀单独无法消除的基质。(2)使用近年来研发的磷脂去除板。(3)优化色谱条件:离子化合物加入离子对试剂或加入酸碱调节剂等使其在液相色谱中与基质分离。(4)降低流速和进样量。(5)使用二维色谱法。(6)若ESI基质效应太强,可考虑选用APCI或近年来新兴的APPI。(7)内标物尽量选用稳定同位素标记物而非结构类似物。目前,基质效应及其消除方法仍有待深入研究,从而为更灵敏的液质联用法测定吸入平喘药血药浓度提供理论和实践依据。
 
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